Abstracts

Caractérisation moléculaire du gène codant 3'Nucleotidase Nulcease du parasite Leishmania major

Elakhal Naouar Inès, Ben Achour-Chenik Yosser, Boublik Yvan, Fattoum Abdellatif, Louzir Hechmi, Chenik Mehdi.

Dans le but d'élucider les bases moléculaires de la virulence du parasite Leishmania, nous avons comparé l'expression des gènes entre des isolats sauvages de Leishmania major de pouvoir pathogène contrasté (Kebaier and al, 2001) en utilisant la technique de Differential Display suivie de RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats ont permis d'identifier 8 clones différentiellement exprimés dont le clone p14 codant pour un nouveau gène associé à la virulence de Leishmania major appartenant à la famille des protéines disulfide isomérase baptisé LmPDI (Ben Achour et al, 2002) et le clone p6 qui a fait l'objet de notre étude. Pour caractériser ce clone, nous avons tout d'abord déterminé le cadre de lecture ouvert (ORF) correspondant à ce clone. Fait intéressant, cette ORF présente 63% d'homologie avec la 3'Nucleotidase Nuclease de Leishmania mexicana de plus le gène isolé est spécifique de l'espèce L. major vu que son homologue chez L. infantum présente un arrêt précoce dans la traduction. Cette protéine est impliquée dans le processus d'incorporation des purines vu que le parasite soit incapable de synthétiser ces purines de novo. L'analyse de l'expression de ce gène par RT_PCR en temps réel a permis de confirmer la surexpression de ce clone chez l'isolat hautement virulent par rapport à l'isolat peu virulent et de démontrer qu'au sein de l'isolat HV, ce gène est surexprimé au satde amastigote par rapport au satde promastigote métacyclique. Pour caractériser la 3'Nucleotidase Nuclease native chez le parasite Leishmania major, nous avons produit puis purifié la partie C terminale de cette protéine (dans le système pET/BL21) que nous avons utilisée pour produire des anticorps polyclonaux chez le lapin. La production de la protéine entière dans ce système nous a été impossible. Ces anticorps nous ont permis de caractériser la protéine native de 43kDa au niveau de lysats parasitaires. La protéine entière recombinante a été produite par la suite dans le système d'expression eucaryote baculovirus/cellules d'insectes. Cette protéine ne semble pas présenter ni d'activité 3'Nucleotidase ni d'activité nucléase testées in situ. Des expériences d'IF nous ont permis de confirmer la localisation membranaire de cette protéine comme prédit par le logiciel TMHMM.
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